Виды посттрансляционной модификации аминокислот в белках. Модификации хромосомных белков

(от позднелат. modificatio-изменение) биогенная, происходит после завершения трансляции матричной рибонуклеиновой к-ты, или мРНК, (синтез белка на мРНК-матрице) или до ее завершения. В первом случае М.б. наз. п о с т т р а н с л я ц и о н н о й, во втором -к o т р а н c л я ц и о н н о й. Осуществляется благодаря реакциям разл. функциональная группаминокислотных остатков, а также пептидных связей и обусловливает конечную форму белковой молекулы, ее физиологический активность, стабильность, перемещения внутри клетки.

Внеклеточные (секретируемые) белки, а также мн. белки цитоплазматич. мембраны и разл. внутриклеточных ком-партментов (обособленных участков клетки) подвергаются гликозилированию, в результате к-рого образуются глико-протеины. Наиб. сложно организованы маннозосодержащие цепи, присоединенные к полипептидам N-гликозидной связью. Начальная стадия формирования таких цепей протекает котрансляционно по схеме:

Dol-долихол (полипренол), Dol-Р-Р-долихолпирофосфат, Glc-глюкоза, GlсNАс-N-ацетил-D-глюкозамин, Маn-манноза

Послед. стадии осуществляются посттрансляционно с участием неск. ферментов, локализованных в разных субклеточных компартментах. Так, для G-белка вируса везикулярного стоматита, гликозидные цепи к-рого построены из 15 углеводных остатков, установлена такая последовательность событий. Сначала в эндоплазматич. ретикулуме происходит в две стадии отделение терминальных остатков глюкозы с участием двух разных глюкозидаз. Затем ман-нозидазы (I и II) удаляют 6 остатков маннозы, а N-ацетил-D-глюкозаминтрансфераза осуществляет присоединение трех остатков GlcNAc к остаткам маннозы гликопротеина. Наконец, в комплексе Гольджи с этими остатками связываются с участием соответствующих трансфераз остатки фукозы, галактозы и сиаловой к-ты. Моносахаридные остатки могут подвергаться фосфорилированию, сульфированию и др. модификациям.

Гликозилированию секретируемых белков предшествует протеолитич. процессинг - отделение от N-конца поли-пептидной цепи "сигнальной" последовательности аминокислот. В эукариотич. клетках (клетки всех организмов, за исключением бактерий и синезеленых водорослей) этот процесс осуществляется контрансляционно, в прокариотич. клетках (клетки бактерий и синезеленых водорослей) он может протекать посттрансляционно. Наиб. распространенные сигнальные последовательности включают 23 аминокислотных остатка. Характерные особенности этих последовательностей -наличие на конце короткого положительно заряженного участка, за к-рым следует гидрофобный участок, содержащий от 7 до 14 аминокислотных остатков. Сигнальные последовательности завершаются консервативным по длине (5-7 остатков) гидрофильным участком, на С-конце к-рого чаще всего находятся остатки аланина, глицина, серина, треонина, цистeина или глутамина.

Почти все функцион. классы внеклеточных белков (ферменты, гормоны, иммуноглобулины и др.) содержат ди-сульфидные связи. Они образуются из групп SH цистенна в ходе многостадийного процесса с участием фермента ди-сульфидизомеразы. На его ранних стадиях появляется значит. кол-во "неправильных" дисульфидных мостиков, к-рые ликвидируются в результате тиол-дисульфидного обмена, в к-ром, по-видимому, участвует цистамин (H 2 NCH 2 CH 2 S) 2 . Предполагают, что такой "перебор" связей происходит до тех пор, пока не возникает наиб. стабильная третичная структура, в к-рой дисульфидные мостики "захоронены" и вследствие этого недоступны реагентам.

К наиб. распространенным модификациям внутриклеточных белков относятся фосфорилированис и дефосфорилиро-вание по группе ОН остатков серина, тирозина и треонина, к-рые осуществляются с участием ферментов протеинкиназ и фосфатаз по схеме:

АТФ - аденозинтрифосфат, АДФ - аденозиндифосфат, Р -фосфорная к-та или ее остаток

Фосфорилирование сопровождается активацией или инактивацией ферментов, напр. гликозилтрансфераз, а также изменением физико-химический св-в неферментных белков. Обратимое фосфорилирование белков контролирует, напр., такие важные процессы, как транскрипция и трансляция, метаболизм липидов, глюконеогенез, мышечное сокращение.

Белки митохондрий и хлоропластов, кодируемые ядерными ДНК, имеют на N-конце избыточные аминокислотные последовательности, к-рые избирательно направляют полипептидные цепи в определенные компартменты органелл, после чего отщепляются в результате протеолиза с участием специфич. эндопептидаз. Избыточные последовательности предшественников митохондриальных белков существенно различаются по кол-ву аминокислотных остатков; их может быть от 22 до 80. Короткие последовательности характеризуются высоким (20-25%) содержанием положительно заряженных аминокислотных остатков, равномерно расположенных по полипептидной цепи. Длинные последовательности включают дополнительно участок, состоящий из гидрофобных аминокислот, к-рый "заякоревает" предшественник в липидном бислое митохондриальных мембран.

Известны предшественники для ряда гормонов (напр., для гастрина, глюкагона и инсулина), к-рые переходят в активную форму посредством расщепления полипептидной цепи в участках, содержащих два последовательно расположенных остатка основных аминокислот (аргинин и лизин). Расщепление осуществляется с участием специфич. эндопептидазы, действующей в ансамбле со вторым ферментом, имеющим карбоксипептидазную активность. Последний удаляет остатки концевых основных аминокислот, завершая превращ. пептида в активный гормон. К белкам, подвергающимся протеолитич. активации, относятся также протеиназы (пепсин, трипсин, химотрипсин), альбумины, проколлаген, белки системы свертывания крови и др. В нек-рых случаях неактивные формы ферментов (зимогены) необходимы для временной "консервации" ферментов. Так, зимогены трипсина и химотрипсина (соотв. трипсиноген и химотрипсиноген) синтезируются в поджелудочной железе, секретируются в тонкий кишечник и только там под действием специфич. ферментов превращ. в активную форму.

Широкий круг белков (гистоны, миозин, актин, рибо-сомальные белки и др.) метилируются посттрансляционно по остаткам лизина, аргинина и гистидина (N-метилирова-ние), а также по остаткам глутаминовой и аспарагиновой к-т (О-метилирование). В качестве метилирующего агента обычно выступает S-аденозилметионин .

В нек-рых эукариотич. клетках более половины р-римых белков ацетилированы по N-концу. Этот процесс может осуществляться ко- и посттрансляционно (на схеме обозначено соотв. К. Т. и П. Т.), напр.:

HSCoA-кофермент А, АсСоА - ацетилкофермент A, Met-метионин, Asp - аспарагиновая к-та

Для пептидов, содержащих от 3 до 64 аминокислотных остатков и секретируемых в разл. органы(гастрин, секретин, холецистокинин и др.), обнаружено посттрансляц. амидиро-вание остатка С-концевой аминокислоты (за исключением концевых остатков аргинина и аспарагина).

Нек-рые типы модификаций характерны для отдельных белков или небольших групп белков. В частности, в коллагене и неск. др. белках со сходными аминокислотными последовательностями обнаружены 4- и 3-гидроксипролин, а также 5-гидроксилизин. Гидроксилирование остатков про-лина и лизина протекает котрансляционно и имеет важное значение для формирования уникальной структуры коллагена. Гидроксилизин участвует в образовании ковалент-ных сшивок между полипептидными цепями коллагена по схеме:

Ядерные белки (гистоны, негистоновые белки) подвергаются аденозиндифосфатрибозилированию и полиаденозин-дифосфатрибозилированию, в ходе к-рого аденозиндифос-фатрибозильные остатки переносятся от кофермента ни-котинамидадениндинуклеотида (НАД) к акцепторным белкам:

Эти две р-ции различны во мн. аспектах. В частности, полиаденозиндифосфатрибозилирование протекает в при-сут. ДНК. Большинство аденозиндифосфатрибозильных групп присоединяется к белкам посредством эфирной связи, образованной группой ОН в положении 5" остатка рибозы и группой СООН С-концевой аминокислоты или глутаминовой к-ты, находящейся внутри полипептидной цепи.

Большое значение имеет карбоксилирование остатков глутаминовой к-ты с образованием g-карбоксиглутаминовой к-ты в предшественнике протромбина. Эта реакция катализируется витамин К-зависимой карбоксилазой, локализованной в мембранах эндоплазматич. ретикулума. Аналогичная реакция протекает при созревании нек-рых др. факторов свертывания крови.

Лит.: Основы биохимии, пер. с англ., т. 1, М., 1981, с. 277-80; Общая органическая химия, пер. с англ., т. 10, М., 1986, с. 543-70; The enzymology of post-translational modification of proteins, v. 1, L.-N. Y., 1980; The biochemistry of glycpproteins and proteoglycans, N. Y.-L., 1980; Cell biology. A comprehensive treatise, v. 4-Translation and the behavior of proteins, N. Y., 1980; Methods in enzymology, v. 106, N.Y., 1984; Hurt E.G., Loon A.P.G.M. van, "Trends in Biochem. Sci.", 1986, v. 11, № 5. n. 204-07. В. Н. Лузиков.

Во многих случаях белки синтезируются в виде предшественников – биологически неактивных молекул.Их функциональная активность проявляется в результате превращений, называемых постсинтетической или посттрансляционной модификацией (процессинг) .

Примеры посттрансляционной модификации белков:

Протеолитическое отщепление N-концевого формилметионина или метионина;

Отщепление сигнальных пептидов;

Частичный протеолиз;

- посттрансляционная модификация белков по аминокислотным радикалам: ковалентное присоединение простетической группы, метилирование радикалов лизина и аргинина, ацетилирование N-концевой аминокислоты, фосфорилирование гистонов и негистоновых белков хроматина, гидроксилирование радикала пролина; присоединение олигосахаридных фрагментов (гликозилирование) к радикалам аспарагина, серина и треонина и т.д.

Выбор правильной структуры белка происходи при участии белков шаперонов . Гидрофобные участки на поверхности глобулы шаперонов-70 взаимодействуют с гидрофобными участками синтезированной цепи, защищая ее от неравильных взаимодействий с другими белками цитозоля. Шапероны-60 участвуют в исправлении пространственной структуры неправильно свернутой или поврежденной цепи.

Мутации в шапероне, входящем в состав хрусталика глаза, приводят к помутнению хрусталика из-за агрегации белков и развитию катаракты.

Транспорт синтезированных белков через мембраны

Синтезированный белок поступает из рибосомы в цитозоль. Если он не используется для нужд самой клетки, т.е. относится к экспортируемым (секретируемым) белкам , то он переносится через мембрану при помощи низкомолекулярных пептидов (15-30 аминокислотных остатков), содержащих гидрофобные радикалы. Это сигнальные пептиды . В мембране формируется канал, через который сигнальный пептид проникает внутрь цистерны эндоплазматического ретикулума, и протаскивает за собой синтезируемую молекулу белка. Под действием сигнальной пептидазы N-концевая сигнальная последовательность отщепляется, а белок через аппарат Гольджи выходит из клетки в форме секреторного пузырька.

РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКА

Концентрация многих белков в клетке непостоянна и изменяется в зависимости от состояния клетки и внешних условий. Это происходит в результате регуляции скоростей синтеза и распада белков.

В клетках млекопитающих существуют два вида регуляции биосинтеза белков :

- кратковременная , обеспечивающая адаптацию организма к изменениям окружающей среды;

- длительная, стабильная , определяющая дифференцировку клеток и разный белковый состав органов и тканей.

Наиболее распространенным механизм регуляции синтеза белков является регуляция на уровне транскрипции (образования первичного транскрипта).

Синтез в базальном состоянии называют конститутивным синтезом .

Различают две формы регуляции – индукция синтеза (положительная регуляция) и репрессия синтеза (отрицательная регуляция). Понятия индукции и репрессии предполагают изменение скорости синтеза белка по отношению к исходному (базальному) уровню . Если скорость конститутивного синтеза белка высока, то белок регулируется по механизму репрессии синтеза, и, наоборот – при низкой базальной скорости наблюдается индукция синтеза.

Согласно теории Ф. Жакоба и Ж. Моне, в генетическом аппарате бактериальной клетки существуют опероны – отрезки ДНК, содержащие структурные гены определенных белков (цистроны ), и регуляторные участки.

Считывание генетического кода начинается с промотора , расположенного рядом с геном-оператором . Ген-оператор расположен на крайнем отрезке структурного гена. Он либо запрещает, либо разрешает репликацию мРНК на ДНК.

Деятельность оперона контролирует ген-регулятор . Белок-репрессор осуществляет связь опероном и геном-регулятором. Репрессор образуется в рибосомах ядра на мРНК, синтезированной на гене-регуляторе. Он образует комплекс с геном-оператором и блокирует синтез мРНК, а, следовательно, и белка. Репрессор может связываться с низкомолекулярными веществами – индукторами, или эффекторами. После этого он теряет способность связываться с геном-оператором, ген-оператор выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК. Это индукция синтеза (рис. 14).

У эукариот механизмы регуляции синтеза белка более сложные. Преобладают положительные регуляторные механизмы. Основной регуляторной точкой является стадия инициации транскрипции. Регуляторные элементы, стимулирующие транскрипцию, называют энхансерами , а подавляющие ее – сайленсерами . Они могут располагаться как рядом с промотором, так и на удалении от него, и избирательно соединяться с белками-регуляторами : энхансеры – с белками-индукторами , сайленсеры – с белками-репрессорами . Процесс взаимодействия регуляторных элементов с белками-регуляторами регулируется сигнальными молекулами – гормонами, некоторыми метаболитами.

Знание особенностей структуры и функционирования рибосом прокариот и эукариот позволило разработать новые типы антибиотиков. Синтез нуклеиновых кислот и белков является ключевым процессом, необходимым для поддержания жизнедеятельности клетки. Если его каким-либо образом выключить - клетка погибнет. Существуют лекарственные препараты, нарушающие синтез пуриновых оснований и аминокислот, синтез нуклеиновых кислот (рис. 16), синтез белка на различных уровнях только в клетках бактерий (таблица 4).

Рис 16. Препараты, нарушающие синтез нуклеиновых кислот

Таблица 4

Средства, угнетающие синтез белков бактериальной клетки

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Генная инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

1. Специфическое расщепление ДНК рестриктазами. В качестве мишеней рестриктаз часто выступают палиндромы из 4-6 пар оснований - сайты рестрикции. Одни рестриктазы вносят разрывы по оси симметрии, образуются так называемые "тупые" концы. Другие - со сдвигом, образуются "липкие" концы, то есть фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в четыре нуклеотида. Такие фрагменты особенно удобны для создания рекомбинантных ДНК.

2. Секвенирование нуклеотидов. С помощью электрофореза фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, можно разделить, а затем исследовать каждый фрагмент отдельно. Это позволяет построить рестрикционную карту , на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других участков.

3. Конструирование рекомбинантной ДНК:

Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК с помощью рестриктазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате чего образуются «липкие» концы. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, создают «липкие» концы, используя ту же рестриктазу. Если смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединятся «липкими» концами. Затем с помощью лигазы вновь получают кольцевую молекулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК .

Возможны:

- сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод). Комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований. Для восстановления разрывов используют фермент ДНК-лигазу.

- сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод). Тупые концы могут быть соединены ДНК-лигазой. Эффективность реакции ниже, чем при сшивке по липким концам.

- сшивка фрагментов с разноименными липкими концами. Применяют линкеры - химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец".

Описанная выше процедура сложна и позволяет получать лишь очень небольшие количества рекомбинантной ДНК.

4. Клонирование (размножение) рекомбинантной ДНК:

- клонирование ДНК in vivo .

Если к культуре Е. coli добавить рекомбинантные плазмиды, то они могут включаться в бактериальные клетки - получаются рекомбинантные бактерии. Плазмиды в клетке начинают реплицироваться. При размножении бактерий вновь образующиеся бактериальные клетки тоже содержат эти плазмиды. Из рекомбинантных бактерий можно выделить клонированные рекомбинантные плазмиды, а из них - исследуемый фрагмент ДНК. Таким путем можно выделить ген или любой другой фрагмент ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей.

- аплификация (увеличение числа копий)ДНК in vitro.

В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке 2 синтетических праймера. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок называют ампликоном . Амплификация заключается в повторяющихся циклах, представляющих собой трехступенчатый процесс: I - денатурация ДНК при 95 °С; II - отжиг праймеров с комплементарными последовательностями (40-60 °С); III - последующая достройка полинуклеотидных цепей от праймеров с помощью ДНК-полимеразы при температуре 70-75 °С (рис. 17).

Продолжительность одного цикла менее 3 мин. Таким образом, за 2 ч можно получить около миллиарда копий определяемой последовательности ДНК. Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. ПЦР называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning).

С использованием ПЦР разработаны новые диагностические тесты на генетические и инфекционные заболевания. Метод используют для ранней диагностики наличия в организме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Метод анализа индивидуальных сперматозоидов нашел практическое применение в судебной медицине. С помощью ПЦР удалось амплифицировать и клонировать фрагменты митохондриальной ДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет.

5. Введение гена в клетку. Ген нужно ввести в клетку таким образом, чтобы он не был разрушен клеточными нуклеазами, а интегрировался с геномом клетки. Используют 2 способа.

Трансдукция.

Вектор - молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в клетку-рецепиент и встроить ее в геном.

В состав вектора должен входить маркерный ген , позволяющий селектировать измененные клетки. Можно выделить 2 группы маркерных генов:

- селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам или гербицидам;

- репортерные гены , кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано.

За способность гена к экспрессии отвечают регуляторные последовательности , которые также необходимо встроить в векторную молекулу.

Типы векторов:

- бактериальные плазмиды. Одна их наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования pBR 322 создана на основе плазмид, выделенных из E. coli;

- вирусы. Есть вирусы, которые не ведут к гибели клетки, но встраиваются в геном клетки-хозяина и размножаются вместе с ней, либо вызывают ее неконтролируемый рост, т.е. превращают в раковую;

- гибридные векторы , содержащие ДНК фага и плазмиды - космиды и фазмиды.

2. Прямое введение гена в клетку – трансформация. Ее виды:

Трансфекция. ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.

Микроинъекция ДНК с помощью микропипеток диаметром 0,1-0,5 микрона и микроманипулятора.

Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран.

«Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток в митозе колцемидом . Вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Затем их обрабатывают цитохалазином В и центрифугируют. Образуются мини-клетки - микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану. Для их слияния подбирают специальные мягкие условия.

Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз.

Метод биологической баллистики является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений. На мельчайшие частички вольфрама напыляется ДНК вектора. Они помещаются внутрь биолистической пушки, откуда с огромной скоростью выбрасываются и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

С развитием генной инженерии появилась возможность заставить микроорганизмы синтезировать вещества, которые получить другими методами сложно - интерферон, инсулин, соматостатин, соматотропин, фермент урокиназу, некоторые факторы свертывания крови и др. Все эти белки применяются для лечения болезней.

Плазмиды можно ввести и в клетки эукариот. Генетическая транформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки, что имеет огромное значение для медицинской генетики.

На этой стадии происходит формирование третичной структуры и процессинг молекулы полипептида.

Синтезированная на рибосоме полипептидная белковая молекула несет информацию и называется конформационной , т.е. она подвергается превращению (процессингу ) в строго определенное трехмерное тело, несущее уже функциональную информацию.

Это справедливо для белков со структурной функцией, но не для биологически неактивных молекул - предшественников белков. Их функциональная активность проявляется в результате превращений, называемых постсинтетической или посттрансляционной модификацией . В процессе синтеза 20 аминокислот могут быть включены в его состав. После трансляции посттрансляционная модификация расширяет функциональный состав белка:

Отщепление N-конца формилметионина или метионина;

Отщепление сигнальных пептидов;

Присоединение простетической группы;

Фосфорилирование гистонов и негистоновых белков хроматина;

Метилирование радикалов лизина и аргинина;

Присоединение олигосахаридных фрагментов к радикалам аспарагина, серина;

Выбор правильной структуры белка происходит при участии белков - шаперонов . Гидрофобные участки на поверхности глобулы шаперонов-70 взаимодействуют с гидрофобными участками синтезированной цепи, защищая ее от неправильных взаимодействий с другими белками цитозоля. Шапероны-60 участвуют в исправлении пространственной структуры неправильно свернутой или поврежденной цепи.

Транспорт синтезированных белков через мембраны

У эукариот мРНК образуется в ядре и поступает в рибосому, находящуюся в цитозоле клетки. Синтезированной белок поступает из рибосомы в цитозоль. Если он не используется для нужд самой клетки, т.е. относится к экспортируемым (секретируемым) белкам , то он переносится через клеточную мембрану при помощи низкомолекулярных пептидов (15-30 аминокислотных остатков), содержащих гидрофобные радикалы. Это лидирующие или сигнальные пептиды . Сигнальные пептидные последовательности образуются в рибосомах с N-конца при синтезе белка по сигнальным кодонам, расположенным сразу после инициаторного, и узнаются рецепторными участками эндоплазматической сети. В мембране формируется канал, через который сигнальный пептид проникает внутрь цистерны эндоплазматического ретикулума, и протаскивает за собой синтезируемую молекулу белка. Под действием сигнальной пептидазы N-концевая сигнальная последовательность отщепляется, а белок через аппарат Гольджи выходит из клетки в форме секреторного пузырька.

Регуляция синтеза белка

Концентрация многих белков в клетке непостоянна и изменяется в зависимости от состояния клетки и внешних условий. Это происходит в результате регуляции скоростей синтеза и распада белков.

Гены – участки ДНК, кодирующие синтез тРНК, рРНК, мРНК.

Гены, кодирующие синтез мРНК, называют генами белков .

Регуляция на уровне транскрипции (образование первичного транскрипта) – наиболее распространенный механизм регуляции синтеза белков.

Различают две формы регуляции – индукция синтеза (положительная регуляция) и репрессия синтеза (отрицательная регуляция).

Понятия индукции и репрессии предполагают изменение скорости синтеза белка по отношению к исходному (базальному) уровню .

Синтез в базальном состоянии – конститутивный синтез .

Если скорость конститутивного синтеза белка высока, то белок регулируется по механизму репрессии синтеза, и, наоборот – при низкой базальной скорости бывает индукция синтеза.

В генетическом аппарате клетки существуют опероны – отрезки ДНК, содержащие структурные гены определенных белков и регуляторные участки.

Считывание генетического кода начинается с промотора, расположенного рядом с геном-оператором.

Ген-оператор расположен на крайнем отрезке структурного гена. Он либо запрещает, либо разрешает репликацию мРНК на ДНК.

У эукариот преобладают положительные регуляторные механизмы. Основной регуляторной точкой является стадия инициации транскрипции. Регуляторные элементы, стимулирующие транскрипцию, называют энхансерами , а подавляющие ее – силансерами (сайленсерами) . Они могут избирательно соединяться с белками-регуляторами : энхансеры – с белками-индукторами , сайленсеры – с белками-репрессорами .

Белок-репрессор осуществляет связь опероном и геном-регулятором. Репрессор образуется в рибосомах ядра на мРНК, синтезированной на гене-регуляторе. Он образует комплекс с геном-оператором и блокируется синтез мРНК, а, следовательно, и белка. Репрессор может связываться с низкомолекулярными веществами – индукторами или эффекторами. После этого он теряет способность связываться с геном-оператором, ген-оператор выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК.

В клетках млекопитающих существуют два вида регуляции биосинтеза белков :

- кратковременная , обеспечивающая адаптацию организма к изменениям окружающей среды;

- длительная, стабильная , определяющая дифференцировку клеток и разный белковый состав органов и тканей.

Монография известного индийского специалиста в области геронтологии, посвященная изменениям, наступающим при старении в структуре и функциях хроматина, активности ферментов, структуре коллагена и его синтезе, деятельности иммунной и эндокринной систем. Рассмотрены также старение клеток и современные теории старения.

Предназначена для биологов, биохимиков, геронтологов, врачей-гериатров.

Книга:

Посттрансляционная ковалентная модификация происходит в боковых группах аминокислотных остатков нескольких белков . Хромосомные белки - как гистоны, так и НГБ - синтезируются в цитоплазме и затем переходят в ядро, где они связываются с ДНК. Эти белки, особенно гистоны, подвергаются разнообразным посттрансляционным ковалентным модификациям: фосфорилированию, ацетилированию, метилированию и ADPрибозилированию. Ацетилирование NH 2 -концевого серинового остатка гистонов Н1, H2A и Н4 происходит во время трансляции и представляет собой стабильную модификацию . Ацетилирование внутренних лизиновых остатков гистонов Н3 и Н4 и фосфорилирование внутренних сериновых остатков происходит в цитоплазме. Затем эти гистоны переходят в ядра и связываются с ДНК . Ацетилирование внутренних лизинов обратимо. Кроме того, обратимая модификация лизиновых остатков происходит уже после связывания гистонов с ДНК. Путем ковалентных модификаций четырех типов изменяются ионный состав гистонов и их стерические свойства, а следовательно, и взаимодействие с ДНК (рис. 2.4).

Рис. 2.4. Структура хроматина с указанием центров связывания гистонов и НГБ с ДНК. Представлены ковалентные модификации гистонов, в результате которых изменяется их связывание с ДНК

При таких модификациях, как фосфорилирование и ADPрибозилирование, число отрицательных зарядов на гистонах увеличивается, и это может привести к их отделению от ДНК, в результате чего становится возможной ее транскрипция или репликация. При ацетилировании общий положительный заряд на гистонах уменьшается. Это также может приводить к их отделению от ДНК. Вместе с тем при метилировании положительный заряд на молекулах гистонов может увеличиваться, что приводит к более сильному связыванию их с ДНК и, как следствие, к подавлению активности генов. Специфические аминокислоты подвержены специфическим модификациям. Определенные модификации преимущественно происходят в определенных гистонах и к тому же на специфических фазах клеточного цикла и роста клетки. Таким образом, не исключено, что модификации боковых групп хромосомных белков являются механизмом тонкой регуляции экспрессии генов. В табл. 2.3 приведены некоторые характеристики этих модификаций.

Таблица 2.3. Параметры ковалентных модификаций цепей гистонов

Фосфорилирование

Фосфорилирование хромосомных белков представляет собой энергозависимую постсинтетическую модификацию. Оно происходит как в цитоплазме, так и в ядре . Орд и Стокен продемонстрировали включение в гистоны 32 P in vivo. Позднее было показано, что гистон Н1 фосфорилируется в большей степени, чем другие гистоны . Главными центрами фосфорилирования с помощью специфических с АМР-зависимых протеинкиназ являются боковые группы сериновых и треониновых остатков гистонов и НГБ. Лизиновые, гистидиновые и аргининовые остатки фосфорилируются в малой степени. Киназы присутствуют во фракции НГБ хроматина. В фосфорилировании специфических центров, по-видимому, участвуют специфические гистоновые киназы. Из хроматина тимуса быка удалось выделить АМР-зависимую киназу, которая фосфорилирует единственный центр в гистоне Н3 . Дефосфорилирование этих остатков производится фосфатазами, которые также присутствуют во фракции НГБ. Надежно установлено, что фосфорилирование и дефосфорилирование ферментов являются одним из основных механизмов регулирования их активности, поскольку эти модификации, вызывая конформационные изменения, переводят ферменты из активного состояния в неактивное, и наоборот . При подобных модификациях в молекулах хромосомных белков происходят структурные изменения, которые могут приводить к функциональным изменениям хроматина. Реакция фосфорилирования - дефосфорилирования гистона показана ниже:

В молекулах хромосомных белков обнаружены два типа присоединения фосфатных групп . Один из них, включающий связь Р-О, характерен для сериновых и треониновых остатков, причем эта связь устойчива по отношению к кислоте. Второй тип включает связь P-N, которая образуется в лизиновых, гистидиновых и аргининовых остатках. Эта связь неустойчива в кислых средах.

Фосфорилирование гистонов

Процесс фосфорилирования - дефосфорилирования внутренних остатков хромосомных белков совершается с большой скоростью. Быстрое фосфорилирование наблюдается не только в делящихся, но и в неделящихся клетках после их стимуляции различными эффекторами. В основном фосфорилированию подвержен гистон Н1, т. е. фосфорилирование гистонов, по-видимому, не влияет на транскрипционную активность хроматина.

Центры фосфорилирования гистона Н1 различны на разных стадиях клеточного цикла. Ser-37 фосфорилируется в фазе G 1 , Ser-114 в фазах S и G 2 , Ser-180 - в фазе М . По-видимому, это объясняется множественностью Н1-киназ, каждая из которых специфична. Было показано, что быстрорастущие клетки содержат специфичную гистон-киназу, которая катализирует фосфорилирование треониновых остатков, но не Ser-37 и Ser-105 . При фосфорилировании одного из остатков Ser-37 и Ser-105 или обоих степень связывания гистона Н1 с ДНК значительно уменьшается . Такие различия в свойствах разных центров фосфорилирования могут объяснять функциональную роль гистона Н1 в конденсации хроматина. При фосфорилировании различных центров хроматин деконденсируется различным образом, благодаря чему открываются разные участки ДНК.

Показано, что фосфорилирование гистонов связано с изменениями в структуре хроматина особенно во время митоза . Высокая скорость фосфорилирования наблюдается во время митоза клеток яичника китайского хомячка. Такие же модификации наблюдаются в клетках HeLa . Центры фосфорилирования гистона Н1 при митозе (Him) отличаются от центров во время интерфазы (НИ) . Было выдвинуто предположение, что фосфорилирование гистона Н1 необходимо для конденсации интерфазного хроматина в хромосомы . Это совпадает с данными, согласно которым трижды фосфорилированный гистон Н1 связывается с ДНК сильнее, чем дефосфорилированный . У слизистого гриба Prysarum polycephalum фосфорилирование гистона Н1 увеличивается в середине фазы G 2 и резко нарастает вплоть до профазы . Дефосфорилирование происходит в последней стадии митоза.

Фосфорилирование различных центров наблюдается также у гистона Н3, но оно не обнаружено у гистонов Н2А, Н2В и Н4. В детальных исследованиях фосфорилирования гистонов Н1 и Н3 из яичника китайского хомячка в процессе митоза было показано, что у большинства клеток эукариот 2–4 центра в гистоне Н1 фосфорилируются в фазе S и дополнительные центры во время митоза (М) . Центры фосфорилирования в фазах S и М, по-видимому, независимы. Более того, эти центры отличаются от тех, которые участвуют в ответе на действие гормона . На ранних стадиях препрофазы, когда начинается агрегация хроматина, гистон Н1 имеет 1–3 фосфатные группы на молекулу, а гистон Н3 не фосфорилируется . Во время промета- и анафазы, когда хроматин агрегирует, все молекулы гистона Н1, а также Н3 суперфосфорилируются и имеют 3–6 фосфатных групп на молекулу. Это может быть обусловлено 6-10-кратным увеличением в митотических клетках содержания специфической АТР-гистон-фосфотрансферазы . Благодаря суперфосфорилированию фибриллы хроматина способны скручиваться в сверхспирали. В телофазе, когда хроматин дезагрегирует, оба гистона, Н1 и Н3, дефосфорилируются. Когда клетки вступают в фазу G 1 , гистон Н1 полностью дефосфорилируется. Таким образом, суперфосфорилирование гистона Н1m и фосфорилирование гистона Н3 являются митотическими событиями, которые происходят только тогда, когда хромосомы полностью конденсированы. Следовательно, для конденсации хроматина во время митоза необходима высокая степень фосфорилирования гистонов Н1 и Н3, тогда как дефосфорилирование ограничивает этот процесс в интерфазе. Удивляет, однако, тот факт, что при высокой степени фосфорилирования, когда, казалось бы, должна была происходить диссоциация комплекса гистонов Н1 и Н3 с ДНК из-за увеличения отрицательных зарядов на них, наблюдается увеличение конденсации. Для того чтобы выяснить фундаментальный механизм, с помощью которого происходят конденсация и деконденсация хромосом, необходимы дальнейшие исследования. В печени крысы в период развития фосфорилирование гистона Н1 значительно, но оно пренебрежимо мало в печени взрослых животных . Однако фосфорилирование усиливается, когда клетки печени делятся после частичной гепатэктомии . Показано, что в этих условиях отношение числа связей P-O к P-N в печени меняется . P-N-связи обнаруживаются главным образом в гистонах Н1 и Н4. Содержание Hl-киназы на протяжении клеточного цикла не меняется, но количество Н4-киназы увеличивается во время синтеза ДНК. Гистон Н4 также максимально фосфорилируется в фазе S, примем центрами атаки являются гистидиновые остатки. Таким образом, в результате фосфорилирования гистон Н4 может отделяться от ДНК, что способствует ее репликации. Отсюда можно, по-видимому, заключить, что фосфорилирование гистонов необходимо для репликации ДНК, за которой следует деление клетки . Показано, что транскрипция изолированных нуклеосом печени крысы после фосфорилирования усиливается . Фосфорилированный и нефосфорилированный гистоны Н1 отличаются друг от друга по способности подавлять матричную активность хроматина . С помощью метода кругового дихроизма было обнаружено, что фосфорилированные гистоны обладают измененной конформацией . Этим может объясняться тот факт, что модифицированные гистоны вызывают дерепрессию хроматина.

Гистон Н5 также подвержен фосфорилированию. В эритроцитах птиц гистон Н5 фосфорилируется вскоре после его синтеза и затем дефосфорилируется по мере созревания клетки . В отличие от других гистонов гистон Н5 дефосфорилируется в период инактивации генома и конденсации хромосом. Фосфорилированный гистон Н5 не так эффективно вызывает изменение конформации ДНК, как его дефосфорилированная форма. Фосфорилированные остатки (серии) обнаруживаются в областях гистона Н5, имеющих сильноосновный характер и связанных с ДНК. 50 % фосфатов находится в области 1-28, а остальные - на участке 100–200. В процессе сперматогенеза у некоторых видов млекопитающих протамины претерпевают фосфорилирование - дефосфорилирование, что, по-видимому, необходимо для упаковки ДНК .

Фосфорилирование НГБ

НГБ фосфорилированы в высокой степени и содержат как P-O-, так и P-N-связи. Полагают, что их фофорилирование катализируют киназы, отличные от тех, которые катализируют фосфорилирование гистонов. Существенным для фосфорилирования является содержание протеинкиназ и сАМР . Кальцитонин стимулирует фосфорилирование НГБ костных клеток в культуре, особенно белков с малой молекулярной массой (10000-45000), но подавляет фосфорилирование НГБ с большой молекулярной массой. Вместе с тем гормон паращитовидной железы стимулирует фосфорилирование НГБ с большой молекулярной массой. Таким образом, два пептидных гормона, противоположным образом влияющие на метаболизм кальция, могут реализовать свое действие с помощью фосфорилированных НГБ. Стероидные гормоны также индуцируют фосфорилирование НГБ .

Фосфорилирование НГБ зависит от типа клеток и их физиологического состояния . Скорость этого процесса в синхронизированных клетках HeLa in vitro меняется, причем самая большая скорость наблюдается в фазах G 1 и S. Когда покоящиеся клетки LC начинают быстро размножаться, одним из самых ранних событий является фосфорилирование НГБ. При добавлении к ядрам клеток печени крыс полиаминов, спермина и спермидина активность протеинкиназы ядер повышается в 2–3 раза, а скорость фосфорилирования НГБ - во много раз . У Physarlum полиамины стимулируют фосфорилирование нескольких уникальных НГБ .

В отличие от фосфорилированных гистонов, которые влияют на структуру хроматина, фосфорилированные НГБ участвуют в экспрессии генов . Фосфорилированные НГБ клеток HeLa в фазе G 1 стимулируют транскрипцию генов гистона в фазе G 1 , хотя в данной фазе эти гены не активны. Фосфорилированные НГБ усиливают транскрипцию, а дефосфорилированные уменьшают ее . Механизм этого воздействия, вероятно, заключается в непосредственном взаимодействии белков с ДНК. Такой вывод вытекает из следующих наблюдений: НГБ обладают различной способностью к фосфорилированию, способ их фосфорилирования зависит от типа ткани; при изменениях в их фосфорилировании изменяются структура хроматина и активность генов, а фосфорилированные НГБ специфически связываются с ДНК. НГБ клеток карциномы молочной железы в стадии зависимого от гормона роста и во время регрессии фосфорилируются по-разному . Когда хроматин фибробластов W1-38 человека реконструируют из ДНК и нефосфорилированных или фосфорилированных НГБ, в последнем случае степень транскрипции много больше .

Ацетилирование

Есть сообщение о наличии у гистонов ацетильных групп . Ацетилирование гистонов в изолированных ядрах впервые было описано Олфри с сотрудниками . В гистонах обнаружены ацетилированные аминокислотные остатки двух типов: а) NH2-концевой серии гистонов Н1, Н2А и Н4 ацетилируется в N-ацетилсерин; это необратимая постсинтетическая модификация, катализируемая ферментом, содержащимся в цитозоле; б) ацетилированные внутренние лизиновые остатки образуются в результате постсинтетической реакции, протекающей в цитозоле и в ядре после того, как гистоны переходят из цитозоля в ядро и связываются с ДНК . Ацетилирование внутренних остатков в гистоне Н1 либо незначительно, либо вообще отсутствует. Ацетилируется один центр в гистоне Н2А и по четыре центра в каждом из гистонов Н2В, Н3 и Н4. Ацетилирование лизиновых остатков катализируется ацетилтрансферазой, являющейся компонентом НГБ. ?-NH 2 -группы внутренних лизиновых остатков, расположенных на NH 2 -концах половины гистонов, ацетилируются с образованием?-N-ацетиллизина , причем в одной молекуле может содержаться до четырех ацетильных групп. Это энергозависимая реакция, в которой источником ацетильной группы является ацетил-CoA. Деацетилирование катализируется деацетилазой, которая также присутствует в хроматине. Схема реакции приведена ниже:

Ацетилируются внутренние лизиновые остатки 9, 14, 18 и 23 гистона Н3 и 5, 8, 12 и 16 гистона Н4 . Эти остатки расположены в NH 2 -концевой области полипептидной цепи, которая является сильно основной и взаимодействует с кислотными группами ДНК. Ацетилированные гистоны связываются с ДНК менее эффективно, чем деацетилированные . Ацетилирование внутренних лизиновых остатков - процесс обратимый и происходит весьма быстро при самых разных условиях. Период полупревращения реакции ацетилирования очень мал и составляет всего около 3 мин . Были изолированы две гистон-ацетилтрансферазы, имеющие различные оптимумы рН. Ацетилирование ингибируется ионами Mn 2+ . Этот факт представляется важным, поскольку двухвалентные катионы необходимы для функционирования ДНК-зависимой РНК-полимеразы. сАМР, влияющая на фосфорилирование, не действует на ацетилирование . Максимальная скорость ацетилирования достигается в интерфазе, по мере вхождения клеток в митоз она уменьшается. Минимальная скорость реакции наблюдается в профазе и метафазе, когда хромосомы в наибольшей степени конденсированы . По мере того как клетки входят в телофазу и хромосомы увеличиваются в размере, скорость ацетилирования гистона Н4 увеличивается. Минимальный синтез РНК наблюдается в профазе и метафазе, когда хромосомы сильно конденсированы. Важно, что ацетилирование гистона Н4 также минимально именно в этих двух фазах клеточного цикла . Ацетилирование гистонов Н3 и Н4 в эритробластах птиц уменьшается по мере их превращения в зрелые эритроциты, в которых хроматин сильно конденсирован и неактивен ни в транскрипции, ни в репликации . Таким образом, деацетилирование гистонов коррелирует с ингибированием транскрипции, и наоборот, ацетилирование стимулирует транскрипцию. Так как при ацетилировании нуклеосомных гистонов уменьшается их положительный заряд, они могут отделяться от ДНК, благодаря чему ДНК делается доступной для транскрипции.

Если хроматин депротеинизируется, то его транскрипция усиливается . Показано, что при стимуляции синтеза РНК в лимфоцитах митогенами , в тканях-мишенях - гормонами и в печени - после частичной гепатэктомии сначала происходит ацетилирование гистонов. В результате ацетилирования нуклеосомных гистонов усиливается транскрипция хроматина тимуса теленка . Если гистоны Н2А и Н2В добавить к ДНК, лишенной хроматина, то транскрипция подавляется. Однако если эти два гистона затем ацетилируются, то репрессия прекращается. При ацетилировании гистонов Н3 и Н4 также наблюдается стимуляция транскрипции. Показано, что ацетилирование предшествует увеличению синтеза РНК . Ацетилирование гистонов происходит не только в делящихся, но и в неделящихся клетках, в которых значительная часть хроматина неактивна в отношении транскрипции . Ацетилирование гистонов стимулирует удлинение цепей при транскрипции . Возможно, что транскрипция генов, которые специфически "включаются" эффекторами, контролируется степенью ацетилирования гистонов и (или) НГБ.

Приведенные выше заключения подтверждаются следующими фактами. Транскрипционно неактивный гетерохроматин инфузорий имеет низкую степень ацетилирования, тогда как эухроматин транскрипционно активен и сильно ацетилирован . Транскрипционно активные макроядра Tetrahymena pyriformis содержат ацетилированные гистоны, тогда как в репрессированных микроядрах их нет . Активные материнские хромосомы червеца содержат значительно больше ацетильных групп, чем неактивные отцовские хромосомы . В исследованиях, выполненных на клетках Drosophila в культуре , показано, что 14 С-ацетат включается главным образом в гистоны Н3, Н4 и Н2В, а 32 Р-фосфат - в гистоны Н1, Н3 и Н4. Самое высокое содержание как 14 С-ацетата, так и 32 Р наблюдается в гистоне Н3. Когда матрично активные и матрично неактивные области хроматина разделяли после его переваривания ДНКазой II, было обнаружено, что первые содержат большее количество обеих меток (14 С и 32 Р). Эти данные подтверждают предположение, что различия между транскрибируемыми и нетранскрибируемыми областями хроматина отчасти объясняются специфическими модификациями гистонов в определенных локусах.

Степень ацетилирования гистонов из клеток семенника форели изучали путем инкубирования их с 14 С-ацетатом . Гистоны Н2А, Н2В и Н3 ацетилируются в одном положении, в то время как гистон Н4 - в одном, двух, трех и четырех положениях. Когда нуклеосомы, полученные после ацетилирования, обрабатывали трипсином, при этом удаляли NH 2 -концевые области четырех гистонов, содержащие лизиновые остатки и связанные с ДНК. Эти лизиновые остатки как раз и были ацетилированы. Если нуклеосомы затем расщепляли нуклеазой, то освобождались фрагменты ДНК, обычно при наличии NH 2 -концевых областей устойчивые к нуклеазе . Ацетилирование приводит к увеличению скорости расщепления хроматина ДНКазой I . Хроматин, содержащий высокоацетилированные гистоны, легче расщепляется ДНКазой I, но не микрококковой нуклеазой . Когда хроматин из семенника форели гидролизовали ДНКазой II, получали транскрипционно активную фракцию, содержащую высокоацетилированный гистон Н4 . Гистоны Н3 и Н4 клеток HeLa сильно ацетилируются при выращивании в бутирате. Нуклеосомная ДНК таких клеток гидролизуется ДНКазой I в 5-10 раз быстрее. При этом ДНК специфически расщепляется в сайте, где в нормальных условиях разрыва не происходит . Показано также , что ДНКаза I предпочтительно расщепляет ДНК в тех областях хроматина, которые сильно ацетилированы. По-видимому, нуклеосомы в этих областях после ацетилирования подвергаются конформационным изменениям. Поскольку такие изменения необходимы для того, чтобы РНК- и ДНК-полимеразы могли использовать ДНК в качестве матрицы, не исключено, что ацетилирование представляет собой один из. способов, с помощью которого гистоны частично отделяются от ДНК, благодаря чему последняя становится доступной для ферментов. Таким образом, ацетилирование важно как для функционирования хроматина, так и для его структуры и конформации. Высказано предположение, что гистон Н4 связывается с ДНК по механизму, на первых стадиях которого происходит ацетилирование . Затем может произойти деацетилирование, приводящее к электростатическим взаимодействиям, в результате которых закрепляется конформация. В сперматиде морского ежа, не синтезирующей РНК, гистон Н4 полностью деацетилирован, тогда как в эмбрионе, где наблюдается высокая активность генов, он ацетилирован . Таким образом, между ацетилированием гистона Н4 и активностью хроматина наблюдается прямая корреляция.

Изучению роли ацетилирования гистонов в функционировании хроматина способствовало обнаружение того факта, что в присутствии бутирата эта модификация усиливается и гистоны Н3 и Н4 специфически гиперацетилируются , так как бутират ингибирует гистон-деацетилазу. Бутират ингибирует предпочтительно эндогенную деацетилазу гистонов Н3 и Н4 , и при этом он не влияет на скорость ацетилирования . По-видимому, гистон-деацетилаза может играть важную роль в метаболическом контроле ацетилирования. При гиперацетилировании гистонов связанная с ними ДНК в клетках HeLa становится более доступной для ДНКазы I, но не для стафилококковой нуклеазы. ДНКаза I способствует также удалению из комплекса гистонов Н3 и Н4 . Одновременно подавляется синтез ДНК . Можно предположить, что ацетилирование гистонов специфически необходимо для транскрипции и не нужно для репликации. В отличие от фосфорилирования, которое характерно для гистона Н1 и только делящихся клеток, ацеталирование протекает главным образом в гистонах Н3 и Н4 и в делящихся, а также неделящихся клетках, которые метаболически активны. Это подтверждает предположение, согласно которому ацетилирование нуклеосомных гистонов играет важную роль в транскрипции. Об ацетилировании НГБ известно очень мало; в одной из работ сообщается, что ацетилируются белки HMG из ядер тимуса теленка и эритроцитов утки .

Метилирование

Метилирование гистонов является постсинтетической необратимой модификацией, которая катализируется гистон-метилтрансферазой III, присутствующей во фракции НГБ хроматина. Эта модификация была впервые обнаружена Олфри и сотрудниками . Гистон-метилтрансфераза III катализирует переход СН 3 -группы из S-аденозилметионина в?-NH 2 -группу лизинового остатка, как показано ниже:

Эта модификация гистонов происходит после их связывания с ДНК. Метальные группы гистонов в отличие от фосфорильных и ацетильных групп не вступают в дальнейшие реакции . Вследствие этого метилирование является стабильным процессом. Цитоплазматический фермент - метилаза I метилирует аргинин прежде, чем гистон проникает в ядро . НГБ метилируются особым ферментом. С атомом?-N-лизинового остатка могут быть связаны одна, две или три метальные группы, которые последовательно вводятся одним и тем же ферментом. Поэтому метиллизиновые остатки могут представлять собой моно-, ди- или триметиллизин. В основном метилируются гистоны Н3 и Н4. В гистоне Н3 соотношение моно-, ди- и триметиллизинов составляет 1,8:1,0:0,45. В гистоне Н4 отношение моно- к диметиллизину равно 0,7:1,0. Таким образом, гистон Н3 метилирован в большей степени, чем гистон Н4. Очищенные гистоны в противоположность гистонам, связанным с хроматином, являются неподходящими субстратами для метилирования. Метилированные гистоны Н3 и Н4 после выделения могут метилироваться и дальше по центрам, отличным от тех, по которым идет реакция для гистонов, связанных с хроматином. Очевидно, эти дополнительные центры недоступны для метилирования из-за специфической конформации в хроматине. Метиллизины расположены вблизи ацетилированных лизинов.

Метилирование гистонов Н3 и Н4 происходит только в NH 2 -концевой области. Гистон Н3 из тимуса теленка метилируется в Lys-9 и Lys-27, а гистон Н4 - в Lys-20. Оба лизина в гистоне Н3 могут быть моно-, ди- и триметилированы, но в гистоне Н4 триметиллизин не образуется . Гистон Н3 имеет дополнительный центр метилирования - Lys-4. Центры метилирования гистонов Н3 и Н4 так же, как их последовательности аминокислот, чрезвычайно консервативны. K м и V max для метилирования гистонов Н3 и Н4 различны. S-аденозилгомоцистеин - продукт реакции, которую катализирует метилтрансфераза III, - является конкурентным ингибитором субстрата .

Метилирование гистонов клеток HeLa происходит главным образом в S-фазе . В культуре ткани метилирование протекает в течение всего клеточного цикла, но максимальная скорость наблюдается между S- и G 2 -фазами перед началом митоза . Возможно, метилирование необходимо для подготовки хроматина к митозу. После частичной гепатэктомии метилирование гистонов происходит во время важного для клетки периода после S-фазы . Степень метилирования гистонов Н3 и Н4, по-видимому, одна и та же во всех органах, но изменяется с возрастом . У десятидневных крыс молярное соотношение моно-, ди- и триметиллизинов в гистоне Н3 составляет 0,55:1,0:0,35. Молярное соотношение моно- и диметиллизинов в гистоне Н4 в том же возрасте равно 0,1:0,9. С увеличением возраста наблюдается постепенный сдвиг в сторону более метилированных форм. Гистоны Н3 и Н4 в мозгу взрослых крыс не обновляются, так же как не обновляются и их метальные группы независимо от полипептидных цепей . Хонда и др. показали, что метилирование гистонов необратимо и в других тканях. Когда молодым крысам вводили меченый лизин и метионин, значительные количества каждой метки обнаруживали в гистонах мозга. Однако у взрослых особей находили лишь следы этих меток. Если ядра из клеток мозга взрослых крыс инкубировать с S-аденозилметионином, то ни одна метильная группа не включается в гистоны Н3 и Н4. Эти результаты свидетельствуют о том, что метилирование гистонов заканчивается перед наступлением зрелости. Метилированные гистоны могут иметь несколько функций. 1) При метилировании лизиновых остатков, в частности при образовании трифениллизинов, повышается pK ?-NH 2 -группы лизина и увеличивается основность гистонов. Это может усиливать связь гистонов с ДНК. 2) Метилирование гистонов Н3 и Н4 может играть важную роль в структуре нуклеосом. 3) Метилированные гистоны могут необратимо "запирать" ДНК и препятствовать репликации. Возможно, этим объясняется переход клеток в постмитотическое состояние. 4) Метилированные гистоны могут ингибировать транскрипцию. Для оценки роли метилирования гистонов в структуре и функциях хроматина необходимы дальнейшие исследования.

ADPрибозилирование

Есть сообщения, что поли-ADPрибоза ковалентно связывается с ядерными белками . Было показано, что эта реакция катализируется поли-ADPрибозополимеразой, ассоциированной с хроматином . Молекула фермента из тимуса быка состоит из одной полипептидной цепи с мол. массой 130000; этот фермент полностью активен только в присутствии ДНК . Он связан с межнуклеосомной областью хроматина и, по-видимому, способствует образованию структур хроматина высшего порядка . Субстратом в этой реакции служит NAD + . Фермент ингибируется никотинамидом, тимидином, цитокининами и метилксантином . В основном ADPрибозилированию как in vivo, так и in vitro подвергается гистон Н1 и до некоторой степени гистон Н2В. Другие нуклеосомные гистоны в печени крыс модифицируются чрезвычайно слабо (если вообще модифицируются) . Центр ADPрибозилирования в гистоне Н1 все еще окончательно не идентифицирован. Было высказано предположение, что он присоединен эфирной связью к глутамату . С помощью фермента в гистон последовательно внедряется от двух до одиннадцати молекул ADPрибозы. Сообщалось о наличии в ядрах клеток из печени крысы разветвленных цепей ADPрибозы, состоящих из 65 остатков . Модификация, по-видимому, происходит следующим образом:

Фосфорилирование серина препятствует ADPрибозилированию . Серии также может быть ADPрибозилирован . Гистон Н 6 (белок HMG спермы форели), протамины и некоторые компоненты НГБ также ADPрибозилируются . Связь с ADPрибозой неустойчива в щелочной среде . Поли-(ADPрибозо)гликогидролаза отщепляет полимер от гистона . ADPрибозилированные гистоны легче отделяются от хроматина, чем другие модифицированные гистоны. По-видимому, после ADPрибозилирования связь гистонов с ДНК ослабевает. Это происходит из-за увеличения отрицательных зарядов гистонов и, кроме того, из-за большого размера молекулы, которая способна деформировать структуру хроматина . Функция полимеров ADPрибозы, ковалентно присоединяющихся не только к гистонам, но и к НГБ, еще не установлена. Предполагается, что они участвуют в синтезе и репарации ДНК, в образовании структуры хромосом и в дифференцировке клеток. Содержание ADPрибозополимеразы увеличивается в 3–4 раза в G 1 -фазе и в процессе дифференцировки эритролейкозных клеток мышей . В клетках HeLa наиболее интенсивное поли-ADPрибозилирование наблюдается в фазе G 1 , а самое слабое - в фазе S. В результате ADPрибозилирования ядерных белков может происходить их отделение от ДНК, что содействует ее репликации в S-фазе. Таким образом, рассматриваемая модификация может быть необходимой для репликации ДНК. Это подтверждается тем фактом, что синтез ДНК в ядрах, выделенных из печени куриного эмбриона, после ADPрибозилирования увеличивается .

Полиамины - спермин, спермидин и путресцин - стимулируют ADPрибозилирование ядерных белков в упомянутом порядке. Стимулирующим эффектом обладает также Mn 2+ . ADPрибозилирование гистонов Н1 в клетках HeLa увеличивается в присутствии полиаминов почти в 3 раза . Спермин стимулирует ADPрибозилирование НГБ клеток в культуре, а Mn 2+ стимулирует ADPрибозилирование гистонов. Если в инкубационной среде присутствуют и спермин, и Mn 2+ , то НГБ модифицируются в большей степени, чем гистоны. Таким образом, полиамины и ионы металлов оказывают, по-видимому, регулирующее действие на ADPрибозилирование ядерных белков.

Подводя итоги, можно сказать, что ковалентные модификации хромосомных белков, в частности гистонов, могут оказывать значительное влияние на структуру и функции хроматина. Основные характеристики модифицирующих реакций показаны на рис. 2.4 и заключаются в следующем. 1) Фосфорилирование и ADPрибозилирование происходят в основном в гистоне Н1, а ацетилирование и метилирование - в нуклеосомных гистонах. 2) Фосфорилирование, ADPрибозилирование и ацетилирование приводят к уменьшению общего положительного заряда гистонов и к отделению их от ДНК, тогда как метилирование ведет к увеличению положительного заряда, что делает связь с ДНК более сильной. 3) Гистоны могут претерпевать все эти изменения одновременно, что приводит к значительным изменениям их ионной структуры. 4) Фосфорилирование, очевидно, представляет собой общее явление: оно менее специфично по сравнению с другими модификациями и происходит в делящихся клетках в течение всего клеточного цикла. По-видимому, фосфорилирование необходимо для репликации ДНК и деления клеток. Три другие модификации, вероятно, более специфичны. Ацетилирование происходит главным образом в метаболически активных клетках и, по-видимому, включено в процесс транскрипции. Метилирование, будучи необратимым процессом, может быть важным для репрессии активности генов и для дифференцировки. 5) Все эти модификации специфически модулируются специальными эндогенными эффекторами, в том числе гормонами. Специфические и дифференциальные модификации хромосомных белков могут происходить в разные периоды жизни и приводить к избирательной экспрессии генов.

В то время как накоплено значительное количество данных о ковалентных модификациях гистонов, о подобных модификациях НГБ известно относительно мало. Скудна также информация о скоростях и последовательности дефосфорилирования, деацетилирования и де-ADPрибозилирования.

Химическая модификация белков осуществляется с помощью кислотного или щелочного гидролиза, стабилизации белков путем солеобразования, ацилирования, пластеиновой реакции.

Щелочной и кислотный гидролиз. Эти способы модификации белков широко применяются для солюбилизации белков рыбы в процессе получения рыбных белковых концентратов, в результате чего повышается растворимость, эмульгирующая и пенообразующая способности белков.

Глубина гидролиза зависит от вида и концентрации щелочи или кислоты, соотношения субстрата и реагента, температуры, продолжительности обработки. Для достижения определенного результата процесс должен быть оптимизирован для конкретного белка конкретного сырья.

При полном гидролизе белков образуется смесь аминокислот. Это используется в новейших технологиях. Степень гидролиза можно контролировать и корректировать. Но необходимо учитывать, что наряду с положительными последствиями гидролиза, возникают и отрицательные. Например, образование рацематов кислот - пептидов с горьким вкусом.

Одним из примеров подобной модификации является деструкция характерного для бобовых культур, в частности сои, 11-S-глобулина, имеющего глобулярную форму молекулы. Причем четвертичная структура его характеризуется тем, что несколько субъединиц объединяются в глобулу с помощью межмолекулярных связей. Такие структуры не способны к гелеобразованию, а также к имитации мясоподобных систем. Контролируемый гидролиз позволяет получить белок со свойствами студнеобразователя, что более характерно для ряда фибриллярных белков, например, желатина.

Этот принцип модификации свойств белка нашел широкое применение в технологическом процессе получения структурированных продуктов способом прядения.

Подобным образом можно изменить структуру белка и с помощью нагрева. Распад белка на субъединицы, их частичное разрушение и агрегация приводят к образованию белковых студней. Стабильность полученных гелей зависит от образования дисульфидных мостиков между полипептидными цепями.

Солюбилизация белков путем солеобразования. Возможность такой модификации вытекает из основного свойства белков, как полимерных амфолитов, способных к взаимодействию и с катионами, и с анионами. Возможны два вида взаимодействия: образование солевых мостиков и специфичная сорбция ионов на поверхности белка. При этом образуются протеинаты, которые отличаются большей растворимостью по сравнению с нативными белками.

Образование протеинатов широко используется при выделении белков из сои (соевые протеинаты) и из молока (казеинат и копреципитат натрия).

Наиболее широко из солей-модификаторов используются хлористый натрий и неорганические фосфаты. Так, регулируя способность мясорецептурных композиций удерживать воду используют хлористый натрий, пиро- или триполифосфат натрия, которые повышают растворимость миофибриллярных белков. Одновременно известно, что полифосфаты в отношении белков характеризуются антиденатурационными, антисептическими, антиокислительными свойствами.

С каждым годом использование протеинатов в пищевой промышленности и общественном питании расширяется.

Ацилирование. Ацилирование с помощью уксусного или янтарного ангидридов является одним из широко применяемых приёмов химической модификации белков. Результатом такой модификации является сдвиг изоэлектрической точки белка в более кислую зону. Под действием янтарного ангидрида этот процесс проходит в большей степени. Это дает возможность даже при низкой степени модификации значительно улучшить такие технологические характеристики как растворимость, эмульгирующая и пенообразующая способности.

Введение ацильных остатков (типа R-COO-) способствует развертыванию и, в конечном итоге, разрушению белковой глобулы, что приводит к изменению электростатического равновесия, характерного для нативного белка, за счет блокировки положительно заряженных аминогрупп в глобулинах и повышения роли электростатического отталкивания одноименно заряженных групп. Следствием этого является изменение конформации белка и его диссоциация. Одновременно достигаются такие технологические эффекты, как способность к студнеобразованию.

На практике доказано, что путем ацилирования удается получить модифицированные растительные белки с улучшенной студнеобразующей способностью, причем эта способность и структурно-механические характеристики получаемых гелей зависят от степени ацилирования. Так, при очень высокой степени его избыток отрицательных зарядов вызывает настолько сильное отталкивание полипептидных цепей, что необходимая для студнеобразования агрегация окажется невозможной. То есть, степень ацилирования выступает в роли показателя функциональных свойств белка, а само ацилирование является методом регулирования этих свойств.

Ацилированный казеин молока используется как эмульгатор и стабилизатор эмульсий, загуститель напитков, соусов, плодовых и овощных пюре. Рыбные белки используются как эмульгаторы, связующие вещества, как вещества, образующие желе при термообработке.

Ферментативная модификация белков. Используя ферменты, можно целенаправленно изменять структуру белка в самых разных направлениях. Благодаря частичному гидролизу белка можно обеспечить повышение растворимости, эмульгирующей активности, пенообразующей способности, стабилизации пен и эмульсий. Специфичность ферментов позволяет воздействовать только на определенные участки или группы белковой молекулы. Важно и то, что большинство ферментативных процессов проходит в водной среде и, как правило, в условиях, близких к физиологическим. Однако не все ферментативные изменения белков имеют значение для пищевых технологий.

Так, в последнее время используется частичный гидролиз протеазами белков соединительной ткани, тендеризация мяса для повышения его качественных показателей. У белков рыбы под действием ферментов микробного происхождения амилосубтилина, протосубтилина, бромелина при pH 6,5-7,0 и температуре около 30° С возрастает эмульгирующая активность в 1,5 раза, растворимость повышается на 20%.

Особый эффект достигается при сочетании ферментативного процесса и химической модификации, например, при сукцинации. Так, продукты ферменативного гидролиза рыбных белков, которые характеризуются высокой пенообразующей способностью, в результате сукцинации теряют характерный рыбный вкус, что позволяет использовать их в производстве кондитерской продукции, мороженого, напитков.

Очень хорошие перспективы дает недавно открытая пластеиновая реакция - процесс, обратный ферментативному расщеплению, когда под действием ферментов заново образуются пептидные связи. С помощью этой реакции можно из продуктов гидролиза белка создать полипептидные цепи с молекулярной массой около 3 000 Дальтон. Благодаря тому, что отдельные аминокислоты, в том числе и незаменимые, способны реагировать в форме эфиров, их можно целенаправленно встраивать в полипептиды и белки. Встраивая триптофан, лизин и метионин в зеин кукурузы удалось получить пластеин с хорошей биологической ценностью.

Биологическая ценность белков сои низка из-за незначительного содержания в них серусодержащих аминокислот. Путем частичного гидролиза соевого белка пепсином, смешивания его с таким же гидролизатом кератина шерсти, содержащим много серусодержащих аминокислот, и последующей пластеиновой реакции под действием нагаразы (протеаза Bacilus subtilis) получают пластеин с пищевой ценностью близкой к казеину.

Очень хорошими свойствами обладают пластеины, полученные путем включения в белки глутаминовых кислот, полученных из соевых белков. Во-первых, эти глутаминовые кислоты растворимы при любых значениях pH и стойки к термической коагуляции. Во- вторых, они обладают выраженным вкусом термообработанного мяса.

Огромные перспективы пластеиновая реакция имеет для извлечения из белков нежелательных аминокислот. К последним можно отнести фенилаланин, присутствие которого вызывает тяжкие последствия у больных фенилокетонурией. Частичный ферментативный гидролиз пепсином, извлечение фенилаланиновых пептидов гель-фильтрацией и последующий пластеиновый синтез в присутствии этиловых эфиров тирозина и триптофана под действием растительной протеазы папаина приводит к получению пластеинов, свободных от фенилаланина, но сбалансированных по остальным аминокислотам.

Физико-химические методы модификации. Физико-химические методы воздействия на белковые системы объединяют следующие приемы: комплексообразование с природными полимерами (белками, полисахаридами, др.), а также с мономерами (углеводами, жирами), механические воздействия разного рода, термическую обработку и др.

Комплексообразование по типу белок-белковое взаимодействие нашло практическое применение еще раньше, но теперь появилось научное толкование этого явления. Так было установлено, что совместная сушка белков разной природы - рыбных и зерновых - не только приводит к получению ценных белковых смесей, но и сохраняет функциональные свойства исходных белков. В качестве зерновых добавок к рыбному фаршу могут быть использованы пшеничная, рисовая или другая мука в количестве от 10% до 30%.

Добавка растительных белков к мясным полуфабрикатам, благодаря комплексообразованию обеспечивает минимальное снижение влагоудерживающей способности в процессе термообработки.

Высокими функциональными свойствами характеризуются конъюгаты белков и углеводов, что традиционно используется в технологических процессах. Так, способность сахарозы повышать температуру коагуляции белков яиц широко используется в технологии сладких блюд, кондитерских изделий. Известна способность углеводов стабилизировать белки животного происхождения к действию низко- и высокотемпературной денатурации.

При совместном высушивании рыбных белков с моносахаридами образуются высокорастворимые комплексы, растворимость которых зависит от природы сахаров и их концентрации в рыбном фарше. По влиянию на растворимость получаемого продукта наибольшей эффективностью характеризуется глюкоза, меньшей - сахароза и фруктоза. Аналогично стабилизируют рыбные белки глицерин и модифицированный крахмал. Но следует иметь в виду, что в этом случае создаются условия для протекания реакции Майара, что приведет к снижению пищевой ценности белков.

Добавка глюконо-дельта-лактона стабилизирует мясные фарши.

Известны также методы «укрепления» клейковины муки при образовании ее комплексов с кислыми полисахаридами, такими как производные пектина, а также в присутствии микробного полисахарида ксантана в количестве 0,1-0,5%.

Повышают устойчивость белков к денатурации и липиды, которые тоже способны образовывать комплексы с первыми. Природа этого явления достаточно не выяснена, но все же оно используется в производстве фаршевых колбасных изделий, полуфабрикатом которых являются белково-жировые эмульсии.

Физические методы воздействия также играют определенную роль в модификации свойств белковых веществ. Так, интенсивность, способ и степень помола являются ключевыми при прочих равных условиях в формировании качества пшеничной муки. Устанавливая определенные температурные режимы, регулируют влагоудерживающую способность, нежность, сочность мясных систем. Температурой и продолжительностью обработки регулируют показатели качества молочного творога. Одновременное механическое перемешивание массы приводит к образованию «казеинового зерна», которое существенно отличается по органолептическим показателям от творога, полученного термокислотной коагуляцией, но без перемешивания.

Высокая степень измельчения мясных и рыбных фаршей, особенно на коллоидных мельницах, приводит к механической деградации саркомеров миофибрилл, следствием чего является повышение водоудерживающей способности и растворимости белков.

Частичная термическая коагуляция рыбных белков или заваривание муки, в результате чего происходит денатурация клейковинных белков, изменяют когезию, позволяют регулировать способность к формованию и органолептические свойства систем.